• 黄曲霉毒素(B1)ELLISA检测试剂盒
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【概要】
黄曲霉毒素是曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉的二次代谢产物,是自然界最危险的致癌物质之一,广泛存在于谷物、坚果、 棉籽以及以此为原料生产的各种食品、油料、酒类、饲料中,并能通过动物体产生同样有害的代谢产物,存在于牛奶及奶制品, 肉类甚至人体血液,组织中。
黄曲霉毒素中毒性最强的是黄曲霉毒素 B1,是世界卫生组织规定的 I 类致癌物质,毒性是砒霜的 68 倍,其几乎一直和黄曲霉毒素 B2、G1 和 G2 共存,是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分国家和地区都已对食品和饲料中的黄曲霉毒素最高允许水平作了规定,因此,准确测定食品及饲料中的黄曲霉毒素含量对于食品安全监控具有重要意义。
【适用范围】
可定性、定量检测玉米、大米、麦类、豆类、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素B1。
【试验原理】
    本试剂盒采用竞争 ELISA 原理,在微孔板上预包被黄曲霉毒素 B1 抗原,加入样本/黄曲霉毒素 B1 标准品溶液及辣根过氧 化物酶标记的黄曲霉毒素 B1 抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素 B1 与预包被在微孔板上的黄曲霉毒素 B1 抗原竞争结合 辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 B1 抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入 TMB 显色液,读取吸光值。样本的吸 光值与其所含残留物黄曲霉毒素 B1 的含量成负相关。对照标准曲线,即可得出相应残留物黄曲霉毒素 B1 的含量。
【试剂盒灵敏度】
  试剂盒灵敏度:0.1ppb
【交叉反应率】
结构类似物 交叉反应率
黄曲霉毒素 B1 ……………………………………………      100%
黄曲霉毒素 B2 …………………………………………… 15%
黄曲霉毒素 G1 …………………………………………… 11%
黄曲霉毒素 G2 …………………………………………… 4%
黄曲霉毒素 M1 ……………………………………………
0.5%
【试剂盒组成】
1.96 孔板×1 块
2.标准液×6 瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3. 酶标物 1 瓶  ……………………………………………  7ml
4.显色液 1 瓶  …………………………………………… 12ml
5.终止液 1 瓶  …………………………………………… 10ml
6.浓缩洗涤液 (10×)1 瓶  …………………………50ml
7.浓缩样品稀释液(10×)1 瓶 …………………… 50ml
【需要而未提供的设备及试剂】
设备:
┅微孔板酶标仪 450nm/630nm
 
┅振荡器
┅氮吹仪
┅粉碎机
┅离心机
┅┅天平:感量 0.01g
┅┅微量移液器:单道 20µl~200µl、200µl~1000µl、八道移液器 300µl
试剂:
甲醇(分析纯)
石油醚
去离子水(或蒸馏水)
三氯甲烷
NaCl
【试剂配制】
1.样品稀释液:将浓缩样品稀释液用去离子水按 1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩样品稀释液+9 份去离子水)。
2.洗涤工作液:将浓缩洗涤液用去离子水按 1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩洗涤液+9 份去离子水)。
3.谷物稀释液:将 0.9gNaCl 用配制完成的样品稀释液溶解并定容至 100ml。
4.啤酒稀释液:取甲醇,用配制完成的样品稀释液按 1:4 体积比进行稀释(1 份甲醇+4 份样品稀释液)。
5.50%甲醇:取甲醇,用去离子水按 1:1 体积比进行稀释(1 份无水甲醇+1 份去离子水)。
6.80%甲醇:取甲醇,用去离子水按 4:1 体积比进行稀释(4 份无水甲醇+1 份去离子水)。
【样本前处理步骤】
一、 谷物(大米、玉米、小米等低脂含量)(稀释倍数:8)
1.取 1.0g 粉碎的样品与 8ml 谷物稀释液混合均匀(可根据实验室条件等比例调节样品与谷物稀释液的量);
2.强力振荡 3min;
3.5000g 离心 10min;
4.取上清液 100μl 待测 。
二、 蛋糕(稀释倍数:10)
1.取 1.0g 粉碎的样品与 4ml 50%甲醇混合均匀;
2.强力振荡 3min;
3.5000g 离心 10min;
4.取 400μl 下层液体,加入 600μl 样品稀释液进行稀释,充分混匀;
5.取 100μl 稀释后液体待测 。
三、 花生、奶油蛋糕(稀释倍数:10)
1.取 1.0g 粉碎的样品与 4.0ml 石油醚混合均匀;
2.加入 4ml 50%甲醇混合均匀;
3.强力振荡 3min;
4.5000g 离心 10min;
5.取 400μl 下层液体,加入 600μl 样品稀释液进行稀释,充分混匀;
6.取 100μl 稀释后液体待测 。
四、 食用油(稀释倍数:10)
1. 取 1.0g 样品与 4.0ml 石油醚混合均匀;
2.加入 4ml 50%甲醇混合,振荡 1min;
3.静置 10min;
4.取 400μl 下层液体,加入 600μl 样品稀释液进行稀释,充分混匀;
5.取 100μl 稀释后液体待测 。
五、 饲料、面粉、汤圆(稀释倍数:30)
1.取 5.0g 粉碎的样品与 15.0ml 80%甲醇混合均匀(可根据实验室条件等比例调节样品与甲醇溶液的量);
2.强力振荡 3min;
3.4000g 离心 10min;
4.取1ml上清液加入1ml 80%甲醇溶液混匀;
5.取混匀后液体 100μl,加入 400μl 样品稀释液,混合均匀;
6.取 100μl 稀释后液体待测。
六、 啤酒(稀释倍数:5)
1.   取 200μl 啤酒样品(去除 CO2),加入 800μl 啤酒稀释液(可根据实验室条件等比例调节样品与啤酒稀释液的量);
2.   振荡 3min;
3.   取 100μl 稀释后液体待测。
七、酱油、醋、葡萄酒(稀释倍数:8)
1.取 0.5ml 样品,加入 0.5ml 蒸馏水并加入 4.0ml 三氯甲烷(可根据实验室条件等比例调节样品,水和三氯甲烷的量);
2.混匀振荡 3min,5000g 离心 10min;
3.取 1.0ml 下层液,60℃氮气吹干;
4.加入 100μl 乙腈溶解干燥物,并加入 900μl 样品稀释液,充分混匀;
5.取 100μl 稀释后液体待测。
【检测步骤】
一、 测定前须知:
1.使用之前将所有试剂和所需板条回温(20~25℃)。
2.使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置 2~8℃,干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。3.ELISA 分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是 ELISA 操作中的要点。4.在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖板膜封住微孔板。
二、操作步骤:
1.将所需试剂及微孔板取出,放置室温(20~25℃)30min 以上,液体试剂使用前均须摇匀。
2.取出所需数量的微孔板,将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封,放置于 2~8℃。不可冷冻。
3.洗涤工作液在使用前也需回温。
4.将样本和标准品对应微孔编号,每个样本和标准品做 2 孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5.加标准品/样本 50µl 到对应的微孔中,加入酶标物 50µl/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温避光反应 15min。
6.小心揭开盖板膜,用洗涤工作液充分洗涤,300µl/孔,洗板 5 次,每次间隔 30s,用吸水纸拍干。
7.加入显色液 100µl/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温避光反应 15min。
8.加终止液 50µl/孔,轻轻振荡混匀,设酶标仪于 450nm 处读取每孔 OD 值。
【结果判定】
一、 粗略判定:
用样品平均吸光度值与标准品吸光度值进行比较,就可以大体判断出样品中黄曲霉毒素 B1 的含量。如样品平均吸光度值处于小于浓度为 0.3ppb 标准品的吸光度值,大于浓度为 0.9ppb 标准品的吸光度值,样品稀释倍数为 10,那么可以粗略判定样品中黄曲霉毒素 B1 的含量为 3ppb-9ppb。
二、 准确定量:
1.  百分吸光率的计算 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0 标准)的吸光度值, 再乘以 100%,即
黄曲霉毒素 B1  (Ⅰ型)ELISA 检测试剂盒说明书
 
【概要】
黄曲霉毒素是曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉的二次代谢产物,是自然界最危险的致癌物质之一,广泛存在于谷物、坚果、 棉籽以及以此为原料生产的各种食品、油料、酒类、饲料中,并能通过动物体产生同样有害的代谢产物,存在于牛奶及奶制品, 肉类甚至人体血液,组织中。
 
黄曲霉毒素中毒性最强的是黄曲霉毒素 B1,是世界卫生组织规定的 I 类致癌物质,毒性是砒霜的 68 倍,其几乎一直和黄曲霉毒素 B2、G1 和 G2 共存,是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分国家和地区都已对食品和饲料中的黄曲霉毒素最高允许水平作了规定,因此,准确测定食品及饲料中的黄曲霉毒素含量对于食品安全监控具有重要意义。
【适用范围】
 
可定性、定量检测玉米、大米、麦类、豆类、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素B1。
 
【试验原理】
    本试剂盒采用竞争 ELISA 原理,在微孔板上预包被黄曲霉毒素 B1 抗原,加入样本/黄曲霉毒素 B1 标准品溶液及辣根过氧 化物酶标记的黄曲霉毒素 B1 抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素 B1 与预包被在微孔板上的黄曲霉毒素 B1 抗原竞争结合 辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 B1 抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入 TMB 显色液,读取吸光值。样本的吸 光值与其所含残留物黄曲霉毒素 B1 的含量成负相关。对照标准曲线,即可得出相应残留物黄曲霉毒素 B1 的含量。
【试剂盒灵敏度】
  
  试剂盒灵敏度:0.1ppb
 
【交叉反应率】
 
结构类似物 交叉反应率
黄曲霉毒素 B1 ……………………………………………      100%
黄曲霉毒素 B2 …………………………………………… 15%
黄曲霉毒素 G1 …………………………………………… 11%
黄曲霉毒素 G2 …………………………………………… 4%
黄曲霉毒素 M1 ……………………………………………
0.5%
 
【试剂盒组成】
 
1.96 孔板×1 块
 
2.标准液×6 瓶:(2ml/瓶)
 
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
 
3. 酶标物 1 瓶  ……………………………………………  7ml
 
4.显色液 1 瓶  …………………………………………… 12ml
 
5.终止液 1 瓶  …………………………………………… 10ml
 
6.浓缩洗涤液 (10×)1 瓶  …………………………50ml
 
7.浓缩样品稀释液(10×)1 瓶 …………………… 50ml
 
 
【需要而未提供的设备及试剂】
 
设备:
┅微孔板酶标仪 450nm/630nm
 
┅振荡器
┅氮吹仪
┅粉碎机
┅离心机
┅┅天平:感量 0.01g
 
┅┅微量移液器:单道 20µl~200µl、200µl~1000µl、八道移液器 300µl
 
试剂:
 
甲醇(分析纯)
石油醚
去离子水(或蒸馏水)
三氯甲烷
NaCl
 
【试剂配制】
 
1.样品稀释液:将浓缩样品稀释液用去离子水按 1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩样品稀释液+9 份去离子水)。
 
2.洗涤工作液:将浓缩洗涤液用去离子水按 1:9 体积比进行稀释(1 份浓缩洗涤液+9 份去离子水)。
 
3.谷物稀释液:将 0.9gNaCl 用配制完成的样品稀释液溶解并定容至 100ml。
 
4.啤酒稀释液:取甲醇,用配制完成的样品稀释液按 1:4 体积比进行稀释(1 份甲醇+4 份样品稀释液)。
 
5.50%甲醇:取甲醇,用去离子水按 1:1 体积比进行稀释(1 份无水甲醇+1 份去离子水)。
 
6.80%甲醇:取甲醇,用去离子水按 4:1 体积比进行稀释(4 份无水甲醇+1 份去离子水)。
 
【样本前处理步骤】
一、 谷物(大米、玉米、小米等低脂含量)(稀释倍数:8)
 
1.取 1.0g 粉碎的样品与 8ml 谷物稀释液混合均匀(可根据实验室条件等比例调节样品与谷物稀释液的量);
 
2.强力振荡 3min;
 
3.5000g 离心 10min;
 
4.取上清液 100μl 待测 。
 
二、 蛋糕(稀释倍数:10)
 
1.取 1.0g 粉碎的样品与 4ml 50%甲醇混合均匀;
 
2.强力振荡 3min;
 
3.5000g 离心 10min;
 
4.取 400μl 下层液体,加入 600μl 样品稀释液进行稀释,充分混匀;
 
5.取 100μl 稀释后液体待测 。
三、 花生、奶油蛋糕(稀释倍数:10)
 
1.取 1.0g 粉碎的样品与 4.0ml 石油醚混合均匀;
 
2.加入 4ml 50%甲醇混合均匀;
 
3.强力振荡 3min;
 
4.5000g 离心 10min;
 
5.取 400μl 下层液体,加入 600μl 样品稀释液进行稀释,充分混匀;
 
6.取 100μl 稀释后液体待测 。
 
四、 食用油(稀释倍数:10)
 
1. 取 1.0g 样品与 4.0ml 石油醚混合均匀;
2.加入 4ml 50%甲醇混合,振荡 1min;
 
3.静置 10min;
 
4.取 400μl 下层液体,加入 600μl 样品稀释液进行稀释,充分混匀;
 
5.取 100μl 稀释后液体待测 。
 
五、 饲料、面粉、汤圆(稀释倍数:30)
 
1.取 5.0g 粉碎的样品与 15.0ml 80%甲醇混合均匀(可根据实验室条件等比例调节样品与甲醇溶液的量);
 
2.强力振荡 3min;
 
3.4000g 离心 10min;
4.取1ml上清液加入1ml 80%甲醇溶液混匀;
 
5.取混匀后液体 100μl,加入 400μl 样品稀释液,混合均匀;
 
6.取 100μl 稀释后液体待测。
 
六、 啤酒(稀释倍数:5)
 
1.   取 200μl 啤酒样品(去除 CO2),加入 800μl 啤酒稀释液(可根据实验室条件等比例调节样品与啤酒稀释液的量);
 
2.   振荡 3min;
 
3.   取 100μl 稀释后液体待测。
 
七、酱油、醋、葡萄酒(稀释倍数:8)
 
1.取 0.5ml 样品,加入 0.5ml 蒸馏水并加入 4.0ml 三氯甲烷(可根据实验室条件等比例调节样品,水和三氯甲烷的量);
 
2.混匀振荡 3min,5000g 离心 10min;
 
3.取 1.0ml 下层液,60℃氮气吹干;
 
4.加入 100μl 乙腈溶解干燥物,并加入 900μl 样品稀释液,充分混匀;
 
5.取 100μl 稀释后液体待测。
 
【检测步骤】
 
一、 测定前须知:
 
1.使用之前将所有试剂和所需板条回温(20~25℃)。
 
2.使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置 2~8℃,干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。
 
3.ELISA 分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是 ELISA 操作中的要点。
 
4.在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖板膜封住微孔板。
二、操作步骤:
 
1.将所需试剂及微孔板取出,放置室温(20~25℃)30min 以上,液体试剂使用前均须摇匀。
 
2.取出所需数量的微孔板,将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封,放置于 2~8℃。不可冷冻。
 
3.洗涤工作液在使用前也需回温。
 
4.将样本和标准品对应微孔编号,每个样本和标准品做 2 孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。
 
5.加标准品/样本 50µl 到对应的微孔中,加入酶标物 50µl/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温避光反应 15min。
 
6.小心揭开盖板膜,用洗涤工作液充分洗涤,300µl/孔,洗板 5 次,每次间隔 30s,用吸水纸拍干。
 
7.加入显色液 100µl/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温避光反应 15min。
 
8.加终止液 50µl/孔,轻轻振荡混匀,设酶标仪于 450nm 处读取每孔 OD 值。
 
【结果判定】
一、 粗略判定:
 
用样品平均吸光度值与标准品吸光度值进行比较,就可以大体判断出样品中黄曲霉毒素 B1 的含量。如样品平均吸光度值处于小于浓度为 0.3ppb 标准品的吸光度值,大于浓度为 0.9ppb 标准品的吸光度值,样品稀释倍数为 10,那么可以粗略判定样品中黄曲霉毒素 B1 的含量为 3ppb-9ppb。
 
二、 准确定量:

1.  百分吸光率的计算 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0 标准)的吸光度值, 再乘以 100%,即
                   B
百分吸光率(%)= --- ×100%
                   B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
 
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
 
2.标准曲线的绘制与计算
 
以标准品百分吸光率为纵坐标,黄曲霉毒素 B1 标准品浓度(ppb)的对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光 率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素 B1 实际含量。
【注意事项】
 
1.室温低于 20℃或试剂及样本没有恢复到室温(20~25℃)会导致所有标准的 OD 值偏低。
 
2.在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下 一步操作。
 
3.每种试剂使用前均需摇匀。
 
4.反应终止液为 0.5M 的硫酸,避免接触皮肤。
 
5.不要使用过了有效期的试剂盒;也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
 
6.储存条件: 试剂盒保存于 2~8℃,不能冷冻,将不用的微孔板重新真空密封。标准物质和无色的显色剂对光敏感,因此要避光保存。
7.试剂变质的迹象:显色试剂有任何颜色表明显色剂变质,应当弃之。0 标准的吸光度(450/630nm)值小于 0.5(A450nm<0.5)时,表示试剂可能变质。
 
8.加入显色液后,一般显色时间为 15~30min。若颜色较浅,可延长反应时间到 35min(或更长),但不得超过 40min。 反之,则减短反应时间。
 
9.该试剂盒最佳反应温度为 25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
 
【样品最低检测限】
    
    谷物 …………………………………………………   0.8ppb
蛋糕 …………………………………………………… 1ppb
花生、奶油蛋糕 ……………………………………   1ppb
食用油 ………………………………………………… 1ppb
饲料、面粉、汤圆 ………………………………     2.4ppb
啤酒 …………………………………………………   0.5ppb
酱油、醋……………………………………………    0.8ppb
 
 
【贮藏条件及保存期】
  
    贮藏条件:保存试剂盒于 2~8℃。
 
保存期:该产品有效期为 12 个月。
 
 
 
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值
2.标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标,黄曲霉毒素 B1 标准品浓度(ppb)的对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光 率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素 B1 实际含量。
【注意事项】
1.室温低于 20℃或试剂及样本没有恢复到室温(20~25℃)会导致所有标准的 OD 值偏低。
2.在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下 一步操作。
3.每种试剂使用前均需摇匀。
4.反应终止液为 0.5M 的硫酸,避免接触皮肤。
5.不要使用过了有效期的试剂盒;也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒;不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6.储存条件: 试剂盒保存于 2~8℃,不能冷冻,将不用的微孔板重新真空密封。标准物质和无色的显色剂对光敏感,因此要避光保存。
7.试剂变质的迹象:显色试剂有任何颜色表明显色剂变质,应当弃之。0 标准的吸光度(450/630nm)值小于 0.5(A450nm<0.5)时,表示试剂可能变质。
8.加入显色液后,一般显色时间为 15~30min。若颜色较浅,可延长反应时间到 35min(或更长),但不得超过 40min。 反之,则减短反应时间。
9.该试剂盒最佳反应温度为 25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【样品最低检测限】
谷物 …………………………………………………   0.8ppb
蛋糕 …………………………………………………… 1ppb
花生、奶油蛋糕 ……………………………………   1ppb
食用油 ………………………………………………… 1ppb
饲料、面粉、汤圆 ………………………………     2.4ppb
啤酒 …………………………………………………   0.5ppb
酱油、醋……………………………………………    0.8ppb
【贮藏条件及保存期】
贮藏条件:保存试剂盒于 2~8℃。
保存期:该产品有效期为 12 个月。

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